Osnove mikroskopije i upotreba mikroskopa
Veliki broj osoba koji se počnu baviti istraživanjem i upoznavanjem gljiva iz hobija ili na neki drugi način, doći će do trenutka kada za determinaciju većine gljiva makro karakteristike nisu dovoljne (prije svega zahvaljujući razvijanju spoznaje o ozbiljnosti pristupa proučavanju gljiva i interesovanju same individue), pa se upotreba mikroskopa nameće sama po sebi. Tekst koji slijedi pisan je više iz praktičnog iskustva, zasnovanog na korištenoj literaturi i dostupnim resursima.
Neosporna je ujedno i činjenica da sa mikroskopskim analizama, kako mi miko-entuzijasti volimo reći, počinju i prave glavobolje, koje zahtjevaju potpunu predanost i posvećenost, kako bi se postigli željeni rezultati.
Prije nego li počnete sa ozbiljnijim mikro analizama, pomirite se sa činjenicom da će vas u početku, ali i poslije, ma koliko žarko željeli da odgonetetne sve nalaze koje ste prikupili taj dan, besane noći nekad ostaviti bez rješenja i možda još više zamišljenog nego prije, posebno one koji se uhvate u koštac sa nekim od porodica (rodova) karakteristično teških za determinaciju. No ipak, ne dajte se obeshrabriti, dosta toga će se i rješiti, a praksa je najbolja vježba i trening.
Pa šta je to što nam je potrebno za kvalitetne mikro analize i šta je sve bitno promatrati i analizirati?
Prije svega potrebno je istaći da je mikroskop solidne kvalitete neizostavan alat za svakog mikologa (amatera ili profesionalca), odnosno alat koji nas vodi do potpuno novih spoznaja i naučno-istraživačkog načina promišljanja. Pri kupovini i odabiru mikroskopa, uvijek držite distancu od mikroskopa i proizvođača koji garantuju kvalitet, naglašavajući mogućnost uvećanja do 1600, 2000 ili čak i više puta, a sve to za malu svotu novca. Za analiziranje građe i mikro strukture gljiva najčešće se možemo zadovoljiti uvećanjem do 1000 puta (sa imerzionim uljem), odnosno kombinacijom objektiva sa uvećanjem od 100X i okulara koji povećava 10X.
Zadržite se na proizvođačima i brandovima koji garantuju provjeren kvalitet, iza kojih stoji tradicija (Carl Zeiss, Olympus, Nikon,…), a mnogo takvih i prije svega kvalitetnih ćete naći i među ponudom polovnih i korištenih. Za mikroskop je najvažnije da ima dobru i kvalitetnu optiku (koja će rezultirati jasnim i čistim slikama), te svrsishodno osvjetljenje, a klonite
se kineskih “no name” igrački, koje vas pokušaju obmanuti na svakom koraku kao što je slučaj i sa većinom druge tehnike. Binokularni mikroskop za biološke namjene, kakve nerijetko koriste i na fakultetima za prirodne nauke, će u potpunosti zadovoljiti vaše primarne potrebe (mada je logično da ćete uvijek težiti ka boljem, a novčanik će biti pod stalnim pritiscima). Trinokularni mikroskop je također odličan izbor (prvenstveno za one koji u datom trenutku mogu izdvojiti malo više finansijskih sredstava). U ovom slučaju treći tubus (okular) je predviđen za mikro kameru ili za fotoaparate koji imaju mogućnosti spajanja direktno na okular mikroskopa (adapteri, kovertori ili originalni dijelovi kao što je slučaj kod nekih Nikon-ovih starijih digitalaca – serija Coolpix) što će vam omogućiti direktno i kvalitetno fotografisanje i snimanje onoga što posmatrate. Ovo naravno ni u kom slučaju ne treba biti isključiv uslov, jer se poprilično kvalitetne fotografije mogu dobiti i direktnim prislanjanjem objektiva fotoaparata na okular mikroskopa (sve mikro fotografije korištene u ovom članku su nastale na taj način, uz upotrebu Sony DSC-H2 u makro modu).
Mjerenje dimenzije određenih strukturnih elemenata gljiva je od najvećeg značaja pri provođenju mikroskopskih analiza i determinacija. Mjerenje se obično provodi na način da se izvrši kalibracija mikroskopa i to uz pomoć predmetnog stakla sa mikrometarskom skalom (mikrometar – hiljaditi dio milimetra) na kojem nam je poznata stvarna dužina te skale i podioka na njoj, te mikrookulara (obično 10X) koji posjeduje skalu sa mjernim jedinicama. Posmatrajući skalu na uvećanju od 400 ili 1000 puta odredimo proporciju, te napravimo odnos između mjera na mikrookularu sa onima na predmetnom staklu. Nakon što utvrdimo odnos između ove dvije skale, odnosno utvrdimo koji ekvivalent u mikrometrima odgovara jednom podioku na skali okulara, poprilično lako ćemo vršiti preračunavanje prilikom mjerenja spora ili drugih mikro karakteristika određene vrste.
Šta treba analizirati?
Na ovo pitanje nije lako dati odgovor ili možda jeste – sve! Ako napravimo podjelu na dva najzastupljenija razreda gljiva Ascomycetes i Basidiomycetes onda bi to izgledalo ovako. Ascomycota: askuse (njihov oblik, operculum, zidove, dužinu, širinu, završetak,…), askospore (oblik, dimenzije, ornamentaciju, gutule/uljne kapljice, zidove, nukleus, njihovu brojnost u askusima, zrelost …), parafize (dimenzije, oblik, septiranost, vakuole, pigmentaciju, razgranatost,…), uzdužni presjek (ectal excipulum, medullary excipulum, teksturu excipuluma, oblik i dimezije,…). Basidiomycota: sve vrste cistidija (cheilocystidia – na rubu lamela, pleurocystidia – na licu lamela, dermatocystidia/pileocystidia – na površini klobuka, circumcystidia – na rubu klobuka, te na stručku caulocystidia, od kojih su prve dvije vrste obično najznačajnije za determinaciju), bazidije (broj spora koje nose, njihov oblik i dimenzije), bazidiospore (oblik, dimezije, vakuole, uljna tijela, zidove, njihovu boju, ornamentaciju,…).
Slika 2. – S lijeva na desno: Sowerbyella radiculata (Sowerby) Nannf. – mikroskopija i morfologija. Krajnje desno: Sclerotinia trifoliorum Erikss. – mikroskopija.
Hemijski reagensi i njihova upotreba
Veliki broj mikroskopskih analiza živog, odnosno svježeg materijala (zašto preferirati živo naspram eksikata pogledati ovdje – Vital taxonomy and ecology of Ascomycetes with special regard to inoperculate discomycetes, H.O. Baral) nije potpun bez saznanja kakav uticaj na pojedine makro i mikro strukturne dijelove gljive imaju određeni hemijski reagensi.
Kada su u pitanju najčešće korišteni reagensi ili reagensi okarakterisani kao must haveizdvojićemo samo neke: Lugol-ova otopina ili IKI – rastvor joda u kalijum jodidu (supstitut korištenju Melezerovog reagensa, posebno se zagovara po principima vitalne taksonomije), KOH – kalijev hidroksid (u blažem 3-5% rastvoru koristi se za mikro reakcije i posmatranje određenih gradivnih elemenata uzorka, a u jačem koncetratu za makro reakcije kožice klobuka i sl.), Kongo red ili kongo crveno koristi se za bojenje i isticanje određenih dijelova, Anilin plavo, pamučno plavo – koriste se za bojenje teško vidljivih dijelova, posebno ornamentacije askospora, zatim AgNO3, FeSO4, i drugi.
Kod korištenja hemijskih reagensa uvijek treba voditi računa da je veliki broj njih veoma štetan za čovjeka samim udisanjem ili isparavanjem, ali i dodirom, pa zbog toga trebamo biti oprezni.
Prilikom analiziranja uticaja određenog hemijskog reagensa na materijal koji posmatramo dobro bi bilo voditi računa da prvo nanosimo onaj hemijski reagens koji neće smetati našem živom materijalu, odnosno da za kraj analize (ukoliko za istu koristimo i vitalne i letalne) po mogućnosti ostavimo onaj koji će ostaviti posljedice i prouzrokovati promjene na našem materijalu, tj. učiniti ga mrtvim.
Bitno je reći i da mjerenje određenih dijelova uvijek treba obaviti u običnoj vodi (na taj način izmjerene dimenzije se uzimaju na najreprezentativnije), a tek onda možemo mjeriti koristeći neki od reagensa.
Svoje znanje i rutinu, kada je u pitanja mikroskopska analiza gljiva, uvijek ćete nadopunjavati, tragajući za novom literaturom, praksama i spoznajama, ali će vam u isto vrijeme ovaj čudesan svijet pružiti neizmjerne trenutke satisfakcije prilikom upoznavanja njegove prirode i tajni koje isti brižljivo krije.